学术动态
许琛琦团队与合作者构建可相分离E-CAR免疫受体的理性设计和应用
作者：任正旭 来源自：中国免疫学会 点击数：434 发布时间：2024-12-17
2024年11月27日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）许琛琦研究组联合上海科技大学王皞鹏研究组在免疫学顶级期刊Immunity杂志发表最新合作成果：“Phase separation of chimeric antigen receptor promotes immunological synapse maturation and persistent cytotoxicity”。该研究在传统28Z和BBZ CAR分子胞内段引入TCR中的CD3ε元件（E-CAR），并且通过对CD3ε进行了序列优化来提高E-CAR在细胞膜上的稳定性。E-CAR分子可以通过碱性氨基酸与酪氨酸发生的cation-pi相互作用产生液液相分离（LLPS），促进免疫突触的形成与成熟；这不仅增强了E-CAR接介导的第一信号，也能更好地招募内源共刺激分子。优化后的E-CAR T细胞比普通的CAR T细胞具有更高的抗原敏感性，以及更好的持续杀伤能力，在动物模型中显示了更好的抗肿瘤功能。目前，E-CAR疗法已进入临床试验阶段，展示了良好的应用前景。
嵌合性抗原受体（CAR）
嵌合性抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR）是一种人工合成的免疫受体，它整合了抗体的抗原识别区（ScFv）、T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）的信号区以及共刺激分子（CD28/4-1BB等）的信号区。在T细胞中外源表达CAR分子后，产生的CAR T细胞可以针对特定抗原产生免疫应答反应。CAR T细胞治疗已获批用于肿瘤、自身免疫病等多种场景。但与天然的受体TCR相比，CAR的抗原敏感性较弱，并且与不能有效利用其他免疫受体形成成熟的免疫突触。这些信号的劣势会导致CAR T细胞无法清除低表达抗原的细胞，并且容易发生功能耗竭。从CAR的信号转导功能出发进行优化是突破当前CAR T细胞疗法瓶颈的关键。
CD3ε信号转导机制
T细胞中CD3分子富含多处功能序列，除激活下游信号之外也可以发挥各种调控功能。其中，CD3ε分子胞内段的N端是一段碱性氨基酸富集区（Basic amino acid-rich sequence, BRS），紧接着是一段脯氨酸富集区（Proline-rich sequence, PRS），C端则由一段包含RK序列的免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor activation tyrosine-based motif, ITAM）组成。许琛琦团队及其合作者在前期研究中发现，当T细胞处于静息状态时，BRS与细胞质膜的酸性磷脂发生静电相互作用，将CD3ε的胞内区关键的酪氨酸屏蔽在膜内，防止T细胞产生过强的基底信号（Xu et al., Cell 2008）；当pMHC刺激TCR后，正二价的钙离子大量内流，中和了酸性磷脂的负电荷，从而打破BRS和酸性磷脂的静电相互作用，释放CD3ε胞内区（Shi et al., Nature 2013）；CD3ε BRS随后和酪氨酸激酶LCK发生静电相互作用，产生TCR-LCK的液液相分离现象，这增强了TCR的磷酸化，并进一步促进LCK的活化（Chen et al., PNAS 2023）。CD3ε ITAM单磷酸化的中间态可以招募抑制性激酶CSK，打破TCR-LCK相分离，使得TCR信号回归本底，防止细胞产生过度活化（Wu et al., Cell 2020）。基于这些研究成果，许琛琦团队于2024年荣获国家自然科学二等奖。
许琛琦团队进而将CD3ε引入二代CAR分子，设计出了在功能上更加模拟TCR的第一代E-CAR。在本研究中，团队发现E-CAR 1.0的胞内信号区自身就能够形成液液相分离，而传统二代CAR分子（28Z, BBZ）的相分离现象较弱。这种相分离主要由CD3ε的碱性氨基酸和其它信号区上的酪氨酸苯环所带的pi电子形成的cation-pi相互作用所介导。在细胞水平，E-CAR 1.0更易于在T细胞表面聚集，然而E-CAR在膜上容易被内吞从而不稳定。因此，研究团队通过优化蛋白序列，构建了一种E-CAR 2.0版本（B6I），在保留其相分离所需碱性氨基酸的基础上，有效地提高E-CAR分子在膜上的稳定性。
免疫突触
T细胞与靶细胞接触时形成高度有序的超分子激活簇（Supramolecular activation cluster, SMAC），成熟的TCR免疫突触通常是具有“牛眼”样结构，由TCR形成的central SMAC（cSMAC），由黏附分子LFA-1形成的peripheral SMAC（pSMAC）和富含磷酸酶CD45的distal SMAC（dSMAC）组成。pSMAC和dSMAC之间还有共刺激受体CD2形成的花冠结构，富含CD28，ICOS等多种共刺激分子和PD-1等共抑制受体，共同调控T细胞信号。多层有序的免疫突触结构确保了信号的有效传递。很多研究表明CAR分子不能形成经典的免疫突触结构，CAR分子形成的通常是不规则的微簇结构，这导致其对抗原信号传递低效和对共刺激信号利用不足（Gudipati et al., Nat Immunol 2020; Burton et al., PNAS 2023; Dong et al., EMBO J 2020）。与TCR相比，传统CAR分子只利用了CD3ζ链作为其主要信号传递亚基。其余CD3链的缺失可能导致CAR无法形成成熟的免疫突触。
由于抗原受体聚集是免疫突触形成的基础，E-CAR相分离促进了免疫突触成熟，不仅提升了E-CAR在cSMAC中的信号转导功能，还在外周形成更好的CD2花冠结构，招募PI3K这些信号分子来介导共刺激信号。团队还注意到，E-CAR免疫突触呈现出信号先放大后减弱的动态性，与TCR形成的免疫突触非常相似。
E-CAR功能优势
团队随后对E-CAR T细胞的功能展开了研究，发现其对弱抗原肿瘤细胞的结合与杀伤都更强。通过建立肿瘤细胞反复刺激模型，团队发现E-CAR T细胞的长效杀伤效果更好，在清除肿瘤细胞的同时还可维持自我增殖。RNA测序结果显示E-CAR T细胞可以利用CD2信号来缓解功能耗竭，这与其能诱导形成CD2花冠结构这一现象吻合。在血液瘤和实体瘤的初发肿瘤动物模型以及血液瘤复发的动物模型中，E-CAR T细胞都比传统的细胞表现出了更好的抗肿瘤效果。
综上所述，这一研究通过CAR的蛋白设计，构建了可相分离的新型E-CAR分子，改善了CAR免疫突触的形成与成熟，从而提高了抗原敏感性和细胞持续性，在动物模型中展现了良好的治疗效果。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S107476132400520X
嵌合性抗原受体（CAR）
嵌合性抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR）是一种人工合成的免疫受体，它整合了抗体的抗原识别区（ScFv）、T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）的信号区以及共刺激分子（CD28/4-1BB等）的信号区。在T细胞中外源表达CAR分子后，产生的CAR T细胞可以针对特定抗原产生免疫应答反应。CAR T细胞治疗已获批用于肿瘤、自身免疫病等多种场景。但与天然的受体TCR相比，CAR的抗原敏感性较弱，并且与不能有效利用其他免疫受体形成成熟的免疫突触。这些信号的劣势会导致CAR T细胞无法清除低表达抗原的细胞，并且容易发生功能耗竭。从CAR的信号转导功能出发进行优化是突破当前CAR T细胞疗法瓶颈的关键。
CD3ε信号转导机制
T细胞中CD3分子富含多处功能序列，除激活下游信号之外也可以发挥各种调控功能。其中，CD3ε分子胞内段的N端是一段碱性氨基酸富集区（Basic amino acid-rich sequence, BRS），紧接着是一段脯氨酸富集区（Proline-rich sequence, PRS），C端则由一段包含RK序列的免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor activation tyrosine-based motif, ITAM）组成。许琛琦团队及其合作者在前期研究中发现，当T细胞处于静息状态时，BRS与细胞质膜的酸性磷脂发生静电相互作用，将CD3ε的胞内区关键的酪氨酸屏蔽在膜内，防止T细胞产生过强的基底信号（Xu et al., Cell 2008）；当pMHC刺激TCR后，正二价的钙离子大量内流，中和了酸性磷脂的负电荷，从而打破BRS和酸性磷脂的静电相互作用，释放CD3ε胞内区（Shi et al., Nature 2013）；CD3ε BRS随后和酪氨酸激酶LCK发生静电相互作用，产生TCR-LCK的液液相分离现象，这增强了TCR的磷酸化，并进一步促进LCK的活化（Chen et al., PNAS 2023）。CD3ε ITAM单磷酸化的中间态可以招募抑制性激酶CSK，打破TCR-LCK相分离，使得TCR信号回归本底，防止细胞产生过度活化（Wu et al., Cell 2020）。基于这些研究成果，许琛琦团队于2024年荣获国家自然科学二等奖。
许琛琦团队进而将CD3ε引入二代CAR分子，设计出了在功能上更加模拟TCR的第一代E-CAR。在本研究中，团队发现E-CAR 1.0的胞内信号区自身就能够形成液液相分离，而传统二代CAR分子（28Z, BBZ）的相分离现象较弱。这种相分离主要由CD3ε的碱性氨基酸和其它信号区上的酪氨酸苯环所带的pi电子形成的cation-pi相互作用所介导。在细胞水平，E-CAR 1.0更易于在T细胞表面聚集，然而E-CAR在膜上容易被内吞从而不稳定。因此，研究团队通过优化蛋白序列，构建了一种E-CAR 2.0版本（B6I），在保留其相分离所需碱性氨基酸的基础上，有效地提高E-CAR分子在膜上的稳定性。
免疫突触
T细胞与靶细胞接触时形成高度有序的超分子激活簇（Supramolecular activation cluster, SMAC），成熟的TCR免疫突触通常是具有“牛眼”样结构，由TCR形成的central SMAC（cSMAC），由黏附分子LFA-1形成的peripheral SMAC（pSMAC）和富含磷酸酶CD45的distal SMAC（dSMAC）组成。pSMAC和dSMAC之间还有共刺激受体CD2形成的花冠结构，富含CD28，ICOS等多种共刺激分子和PD-1等共抑制受体，共同调控T细胞信号。多层有序的免疫突触结构确保了信号的有效传递。很多研究表明CAR分子不能形成经典的免疫突触结构，CAR分子形成的通常是不规则的微簇结构，这导致其对抗原信号传递低效和对共刺激信号利用不足（Gudipati et al., Nat Immunol 2020; Burton et al., PNAS 2023; Dong et al., EMBO J 2020）。与TCR相比，传统CAR分子只利用了CD3ζ链作为其主要信号传递亚基。其余CD3链的缺失可能导致CAR无法形成成熟的免疫突触。
由于抗原受体聚集是免疫突触形成的基础，E-CAR相分离促进了免疫突触成熟，不仅提升了E-CAR在cSMAC中的信号转导功能，还在外周形成更好的CD2花冠结构，招募PI3K这些信号分子来介导共刺激信号。团队还注意到，E-CAR免疫突触呈现出信号先放大后减弱的动态性，与TCR形成的免疫突触非常相似。
E-CAR功能优势
团队随后对E-CAR T细胞的功能展开了研究，发现其对弱抗原肿瘤细胞的结合与杀伤都更强。通过建立肿瘤细胞反复刺激模型，团队发现E-CAR T细胞的长效杀伤效果更好，在清除肿瘤细胞的同时还可维持自我增殖。RNA测序结果显示E-CAR T细胞可以利用CD2信号来缓解功能耗竭，这与其能诱导形成CD2花冠结构这一现象吻合。在血液瘤和实体瘤的初发肿瘤动物模型以及血液瘤复发的动物模型中，E-CAR T细胞都比传统的细胞表现出了更好的抗肿瘤效果。
综上所述，这一研究通过CAR的蛋白设计，构建了可相分离的新型E-CAR分子，改善了CAR免疫突触的形成与成熟，从而提高了抗原敏感性和细胞持续性，在动物模型中展现了良好的治疗效果。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S107476132400520X