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蒋争凡团队《Immunity》发文揭示STING蛋白后高尔基体囊泡转运的重要性及分子机制
作者：蒋争凡 来源自：中国免疫学会 点击数：17435 发布时间：2023-03-31
cGAS-STING通路是负责识别胞质DNA免疫应答的主要通路。cGAS作为胞质DNA受体，可以被DNA和/或Mn2+ 激活并利用ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP，后者进一步激活STING并诱导I型干扰素等细胞因子的产生，从而介导抗病毒/肿瘤免疫反应。研究表明多种病原微生物入侵及各种压力胁迫，如氧化应激、代谢紊乱及DNA损伤等都可导致胞质DNA的累积及Mn2+ 浓度的升高，从而激活cGAS-STING通路。因此，cGAS-STING信号通路在抵抗病原微生物感染、肿瘤及多种免疫相关疾病的发生及治疗中都发挥关键作用。
磷脂酰肌醇磷酸（phosphoinositides, PIPs）是构成真核生物细胞膜组分的重要磷脂（占总磷脂的5-10%），也是重要的信号分子。由于肌醇六元环上D-3，D-4或D-5位都可发生磷酸化修饰，因此真核生物中总共存在7种不同PIP分子。PI4P（phosphatydyinositol 4-phosphate）是胞内含量最高的PIP分子，广泛分布于各种膜组分，且在反式高尔基体（trans-Golgi network, TGN）上的含量最高。细胞中的PI4P的含量主要受其合成酶PI4Ks (PI4KA, PI4KB, PI4K2A和PI4K2B)和降解酶SAC1的调控。PI4P不仅是合成PIP2和PIP3的前体，也是重要的信号分子，在膜泡运输、脂质转运和细胞器形态维持等方面发挥关键作用。
2021年蒋争凡实验室利用STING自激活突变体诱导细胞死亡的特性，在HT080细胞中进行了基于CRISPR-Cas9介导的全基因组筛选，发现高尔基体腔内合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）可以通过结合到STING跨膜区的腔内侧，从而诱导STING的寡聚及激活。该论文的讨论部分提到STING和sGAGs的相互作用受到STING腔内侧pH值的调控，并由此推测STING在pH更低的后高尔基体囊泡（post-Golgi vesicles）中会有更高的活性。但是在这个研究中，他们没有探讨STING为什么需要及如何转运到后高尔基体囊泡。
2023年3月14日，北京大学生命科学学院蒋争凡实验室在《Immunity》上以research article形式在线发表了“ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosome trafficking and activation of the antiviral effector STING”，报道了ARMH3作为接头蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通过合成PI4P促进STING从高尔基体到内体的转运（Golgi-to-endosome trafficking）及维持STING激活所需要的脂膜环境（lipid environment），从而帮助STING更加稳定高效的激活。
本工作首先通过CRISPR-Cas9介导的全基因组筛选在HeLa细胞系中鉴定到一个未知功能的新基因C10ORF76 (又名ARMH3)对STING的激活十分重要。ARMH3是一个鲜少被研究的蛋白，为数不多的几篇文章暗示了它对于PI4KB发挥激酶活性来磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol， PI）生成PI4P十分重要。免疫荧光实验发现STING激活后和ARMH3，PI4KB及PI4P都在反式高尔基体有明显的共定位。进一步免疫共沉淀实验显示，STING只有在ARMH3存在的情况下和PI4KB有互作，表明ARMH3在STING和PI4KB之间起到桥梁作用。进一步实验表明ARMH3分别结合位于STING第二、三跨膜区直之间的连接区域及位于PI4KB激酶结构域中间的连接区域。突变掉STING负责结合ARMH3的氨基酸或者利用CRISPR-Cas9原位删除PI4KB与ARMH3互作的关键区域（6个氨基酸残基）都会显著削弱cGAS-STING通路的激活。这些结果表明ARMH3招募PI4KB对于STING的激活十分关键。更重要的是，细胞内敲除ARMH3或者原位删除PI4KB结合ARMH3所需的6个氨基酸，STING在上游通路活化后几乎呈现完全的内质网定位，暗示如果2’3-cGAMP结合后被转运到高尔基体的STING无法被继续转运到后高尔基体囊泡，将会被细胞内COPI介导的从高尔基体向内质网的逆向转运运回内质网，并完全抑制STING的活化。
为了更直接的研究PI4KB对STING激活的影响，他们使用雷帕霉素诱导的FKBP和FRB相互作用，直接招募PI4KB-GFP-FKBP到STING-mCherry-FRB，并发现招募PI4KB到STING会显著促进STING聚集体的形成及下游信号通路的激活，且这种对于STING通路的激活能力完全依赖于PI4KB的激酶活性。相反，招募PI4P的磷酸酶SAC1到STING则会抑制STING聚集体的形成及下游信号通路的激活。表明PI4KB通过在STING周围合成PI4P促进STING的激活。有趣的是，SAC1的敲低会引起的细胞内PI4P水平的异常升高，进而导致STING不依赖于cGAS的自激活。TMEM39A是一个自身免疫性疾病相关基因且被报道参与细胞内的PI4P水平的调控。同样，TMEM39A的敲低也会导致细胞内PI4P的水平的异常升高及STING的自激活，该发现有助于理解TMEM39A相关自身免疫疾病的致病机制。此外，SCAP 和NPC1的突变也被报道可以引起细胞内PI4P的水平的异常升高及STING的自激活，提示胞内PI4P水平的异常升高可能是这些基因突变导致STING自激活的共同原因。
为了研究PI4P如何影响STING的激活，他们对23个PI4P结合蛋白进行了系统性地敲低并发现其中9个成员的降低表达会使STING的激活严重受损。功能分析表明这9个PI4P结合蛋白可以分为两类。其中AP-1和GGA2负责介导高尔基体到内体的膜泡运输。由于内体中相对更低的pH值有利于STING与sGAGs的结合，他们推测PI4P 可以通过指导AP-1和GGA2介导的clathrin-coated vesicles (CCVs) 将STING从高尔基体转运到内体从而避免STING被运回内质网，并且更加强烈激活STING。另一类PI4P结合蛋白均为脂质转运蛋白，其中OSBP和ORPs负责从内质网向高尔基体或内体转运胆固醇，CERT负责神经酰胺从内质网到高尔基体的转运。神经酰胺在高尔基体上会在SGSM1的催化下转化为鞘磷脂，且SGSM1在细胞内的敲除会显著削弱STING的激活，提示鞘磷脂而非神经酰胺直接作用于STING。通过特异的化学小分子破坏胆固醇和鞘磷脂在脂膜上的分布会使STING聚集体逐渐消散并显著抑制STING下游信号通路的激活，表明胆固醇和鞘磷脂对STING聚集体的形成和激活十分关键。以上结果共同表明PI4P还可以通过脂质转运蛋白维持STING活化所需的脂膜环境进而影响STING的激活。此外，Lyz-Cre介导的Armh3条件敲除小鼠实验表明Armh3在机体对抗DNA病毒感染过程中发挥关键作用。
综上所述，该研究发现一个未知功能的接头蛋白ARMH3（可能还具有GEF活性，激活膜泡转运中非常重要的小G蛋白Arf1）在cGAS-STING通路中的重要作用；揭示了STING在到达高尔基体后继续转运及活化的机制；表明STING的高尔基体后转运（post-Golgi trafficking）及脂膜环境对STING的活化十分关键。同时，该研究还发现细胞内PI4P水平的异常升高可以导致STING不依赖于cGAS的自激活，鉴于PI4P在脂质运输及脂质稳态维持中的核心作用，提示STING也有可能作为一个潜在的细胞脂质稳态（危险信号）的感受器（lipid homeostasis sensor）。
生科院/北大-清华生命科学联合中心的蒋争凡教授为通讯作者，北京大学生科院博士后方润和蒋启飞为该文章的共同第一作者。本研究工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点基础研究项目、北京大学“细胞增殖与分化”教育部重点实验室及“北大-清华生命科学联合中心”的资助。
原文链接: https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(23)00078-X
磷脂酰肌醇磷酸（phosphoinositides, PIPs）是构成真核生物细胞膜组分的重要磷脂（占总磷脂的5-10%），也是重要的信号分子。由于肌醇六元环上D-3，D-4或D-5位都可发生磷酸化修饰，因此真核生物中总共存在7种不同PIP分子。PI4P（phosphatydyinositol 4-phosphate）是胞内含量最高的PIP分子，广泛分布于各种膜组分，且在反式高尔基体（trans-Golgi network, TGN）上的含量最高。细胞中的PI4P的含量主要受其合成酶PI4Ks (PI4KA, PI4KB, PI4K2A和PI4K2B)和降解酶SAC1的调控。PI4P不仅是合成PIP2和PIP3的前体，也是重要的信号分子，在膜泡运输、脂质转运和细胞器形态维持等方面发挥关键作用。
2021年蒋争凡实验室利用STING自激活突变体诱导细胞死亡的特性，在HT080细胞中进行了基于CRISPR-Cas9介导的全基因组筛选，发现高尔基体腔内合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）可以通过结合到STING跨膜区的腔内侧，从而诱导STING的寡聚及激活。该论文的讨论部分提到STING和sGAGs的相互作用受到STING腔内侧pH值的调控，并由此推测STING在pH更低的后高尔基体囊泡（post-Golgi vesicles）中会有更高的活性。但是在这个研究中，他们没有探讨STING为什么需要及如何转运到后高尔基体囊泡。
2023年3月14日，北京大学生命科学学院蒋争凡实验室在《Immunity》上以research article形式在线发表了“ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosome trafficking and activation of the antiviral effector STING”，报道了ARMH3作为接头蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通过合成PI4P促进STING从高尔基体到内体的转运（Golgi-to-endosome trafficking）及维持STING激活所需要的脂膜环境（lipid environment），从而帮助STING更加稳定高效的激活。
本工作首先通过CRISPR-Cas9介导的全基因组筛选在HeLa细胞系中鉴定到一个未知功能的新基因C10ORF76 (又名ARMH3)对STING的激活十分重要。ARMH3是一个鲜少被研究的蛋白，为数不多的几篇文章暗示了它对于PI4KB发挥激酶活性来磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol， PI）生成PI4P十分重要。免疫荧光实验发现STING激活后和ARMH3，PI4KB及PI4P都在反式高尔基体有明显的共定位。进一步免疫共沉淀实验显示，STING只有在ARMH3存在的情况下和PI4KB有互作，表明ARMH3在STING和PI4KB之间起到桥梁作用。进一步实验表明ARMH3分别结合位于STING第二、三跨膜区直之间的连接区域及位于PI4KB激酶结构域中间的连接区域。突变掉STING负责结合ARMH3的氨基酸或者利用CRISPR-Cas9原位删除PI4KB与ARMH3互作的关键区域（6个氨基酸残基）都会显著削弱cGAS-STING通路的激活。这些结果表明ARMH3招募PI4KB对于STING的激活十分关键。更重要的是，细胞内敲除ARMH3或者原位删除PI4KB结合ARMH3所需的6个氨基酸，STING在上游通路活化后几乎呈现完全的内质网定位，暗示如果2’3-cGAMP结合后被转运到高尔基体的STING无法被继续转运到后高尔基体囊泡，将会被细胞内COPI介导的从高尔基体向内质网的逆向转运运回内质网，并完全抑制STING的活化。
为了更直接的研究PI4KB对STING激活的影响，他们使用雷帕霉素诱导的FKBP和FRB相互作用，直接招募PI4KB-GFP-FKBP到STING-mCherry-FRB，并发现招募PI4KB到STING会显著促进STING聚集体的形成及下游信号通路的激活，且这种对于STING通路的激活能力完全依赖于PI4KB的激酶活性。相反，招募PI4P的磷酸酶SAC1到STING则会抑制STING聚集体的形成及下游信号通路的激活。表明PI4KB通过在STING周围合成PI4P促进STING的激活。有趣的是，SAC1的敲低会引起的细胞内PI4P水平的异常升高，进而导致STING不依赖于cGAS的自激活。TMEM39A是一个自身免疫性疾病相关基因且被报道参与细胞内的PI4P水平的调控。同样，TMEM39A的敲低也会导致细胞内PI4P的水平的异常升高及STING的自激活，该发现有助于理解TMEM39A相关自身免疫疾病的致病机制。此外，SCAP 和NPC1的突变也被报道可以引起细胞内PI4P的水平的异常升高及STING的自激活，提示胞内PI4P水平的异常升高可能是这些基因突变导致STING自激活的共同原因。
为了研究PI4P如何影响STING的激活，他们对23个PI4P结合蛋白进行了系统性地敲低并发现其中9个成员的降低表达会使STING的激活严重受损。功能分析表明这9个PI4P结合蛋白可以分为两类。其中AP-1和GGA2负责介导高尔基体到内体的膜泡运输。由于内体中相对更低的pH值有利于STING与sGAGs的结合，他们推测PI4P 可以通过指导AP-1和GGA2介导的clathrin-coated vesicles (CCVs) 将STING从高尔基体转运到内体从而避免STING被运回内质网，并且更加强烈激活STING。另一类PI4P结合蛋白均为脂质转运蛋白，其中OSBP和ORPs负责从内质网向高尔基体或内体转运胆固醇，CERT负责神经酰胺从内质网到高尔基体的转运。神经酰胺在高尔基体上会在SGSM1的催化下转化为鞘磷脂，且SGSM1在细胞内的敲除会显著削弱STING的激活，提示鞘磷脂而非神经酰胺直接作用于STING。通过特异的化学小分子破坏胆固醇和鞘磷脂在脂膜上的分布会使STING聚集体逐渐消散并显著抑制STING下游信号通路的激活，表明胆固醇和鞘磷脂对STING聚集体的形成和激活十分关键。以上结果共同表明PI4P还可以通过脂质转运蛋白维持STING活化所需的脂膜环境进而影响STING的激活。此外，Lyz-Cre介导的Armh3条件敲除小鼠实验表明Armh3在机体对抗DNA病毒感染过程中发挥关键作用。
综上所述，该研究发现一个未知功能的接头蛋白ARMH3（可能还具有GEF活性，激活膜泡转运中非常重要的小G蛋白Arf1）在cGAS-STING通路中的重要作用；揭示了STING在到达高尔基体后继续转运及活化的机制；表明STING的高尔基体后转运（post-Golgi trafficking）及脂膜环境对STING的活化十分关键。同时，该研究还发现细胞内PI4P水平的异常升高可以导致STING不依赖于cGAS的自激活，鉴于PI4P在脂质运输及脂质稳态维持中的核心作用，提示STING也有可能作为一个潜在的细胞脂质稳态（危险信号）的感受器（lipid homeostasis sensor）。
生科院/北大-清华生命科学联合中心的蒋争凡教授为通讯作者，北京大学生科院博士后方润和蒋启飞为该文章的共同第一作者。本研究工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点基础研究项目、北京大学“细胞增殖与分化”教育部重点实验室及“北大-清华生命科学联合中心”的资助。
原文链接: https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(23)00078-X