目前，针对新冠病毒（SARS-CoV-2）的核酸检测试剂盒已大量投入使用，但因其检测程序较复杂，需要花费数小时，且检测结果需要经过复核，重复实验则需要花费更多的时间，导致在确诊之前，很多患者得不到及时的隔离和治疗；此外，由于口咽拭子病毒含量较低、病毒RNA易降解等原因，核酸检测常出现假阴性结果。因此，建立快速、准确、安全、有效的新冠病毒特异性检测方法对于准确诊断、控制疫情具有重要的意义。
       作为免疫学检测的一种，酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，简写为ELISA）具有特异性强，灵敏度高，快速简便，结果稳定等特点。用ELISA方法检测SARS病毒N蛋白和血清IgG抗体，是“非典”期间我国医院常用的一个手段。由于免疫检测试剂盒所需的开发时间要长于核酸检测试剂盒，目前针对新冠病毒的ELISA试剂盒还没有正式获批上市。现在我们就来介绍这种正在研发中的病毒的免疫学检测方法——ELISA法。
       ELISA法是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原与抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。那么，ELISA法如何用于新冠病毒的检测呢？
       我们知道，抗原是指能引起抗体生成的物质，抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。Ig是构成抗体的基本单位，在结构上包括重链和轻链两个部分。依据重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，Ig大致可分为5类，即IgM、IgD、IgG、IgA、IgE。其中，IgM占血清Ig总量的5%-10%，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中，IgM是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，血清中IgM升高，提示新近发生感染。IgG是血清和体液中含量最高的抗体，占血清总Ig的75%-80%，IgG是再次免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，在体内分布广泛，具有重要的免疫效应。新冠病毒感染潜伏期为0-14天（中位潜伏期为3.0天），机体的免疫系统会先后产生抗病毒特异性IgM和IgG抗体，检测患者血清中是否存在特异性的抗体可作为新冠病毒感染的诊断指标。一般认为感染7天后，可在患者血清中检测到特异性的IgM（“先锋部队”），10天后可检测到IgG（“主力部队”）。
       冠状病毒有四种主要的结构蛋白：S蛋白、M蛋白、E蛋白、N蛋白。SARS疫情爆发后，科学家们用质谱分析，发现了N蛋白是引起SARS患者产生抗体的主要免疫原（即抗原）。因此N蛋白可用于建立免疫学检测方法，来检测患者血清中存在的针对SARS病毒的抗体。由于新冠病毒与SARS-CoV的N蛋白具有高度的序列相似性，据此推测，N蛋白也可作为抗原用于新冠病毒的ELISA法检测。
       首先，为了获得大量的N蛋白，我们需要对新冠病毒的N蛋白基因进行扩增与克隆，构建N蛋白基因的重组表达质粒，利用大肠杆菌得到大量重组质粒的表达产物——N蛋白，再进行一系列的纯化。接下来，纯化后的N蛋白就可以作为抗原进行ELISA检测了。N蛋白溶液经包被、洗涤、封闭、洗涤等步骤后，加入待检血清进行抗原—抗体反应，加入底物，经显色后测定吸光度值。吸光度值高于设定的临界值，即可诊断为新冠病毒阳性。将一个ELISA试剂盒推向临床运用流程是很长的，要在临床样本中进行批量的检测、校正，要通过多种仪器的测试，要经过有关管理部门的审批。审批通过之后才可能批量生产，最终送到防疫一线对患者进行检测。
       目前，由深圳大学、深圳市第三人民医院及深圳市天深医疗器械有限公司共同研发的新冠病毒IgM和IgG抗体化学发光检测试剂盒已进行了90例样本检测（其中包含58例核酸阳性样本），IgM临床符合率大于90%，IgG临床符合率大于95%。相关试剂盒正在申请绿色通道，申报NMPA证书。这种检测试剂盒仪器小，操作简单快速，22分钟即可得到检验结果。
       诺唯赞医疗研发出了新冠病毒IgG/IgM抗体联合检测试剂盒（胶体金法）和新冠病毒IgG/IgM抗体联合检测试剂盒（量子点荧光免疫法），10分钟即可出结果。这两种IgG/IgM联合检测试剂卡在江苏和广东的三家医院进行了共计205例样本临床验证实验，与临床确诊结果相比（阳性样本55例，阴性150例），阳性符合率为98%，阴性符合率为95%，总一致性百分比为96%。试剂盒已通过江苏省医疗器械注册检验，并正在开展临床验证工作。
       目前，新冠病毒的实验室检测主要依赖核酸检测。核酸检测在感染早期即可呈现阳性，但对于样品保存、核酸提取的实验条件、操作人员的熟练程度以及操作环境等都有较高要求，给大面积早期筛查和诊断带来一定的困难。
       ELISA检测法作为一种免疫检测法，有这样一些优点：临床标本容易采集，而且患者血清一般不含有冠状病毒或者含量低，大大降低检测人员感染风险；有较高的特异性和灵敏度；仪器操作简单，各家医院皆普遍使用；患者在治疗之后继续监测IgM/IgG，可以为医生提供重要的预后判断指标。它的缺点是，患者在被感染7-14天后，才会在血清中出现IgM、IgG抗体，尚不能达到早期诊断的目的。但是ELISA方法可以与核酸检测方法联合，作为新冠肺炎实验室诊断的主要方法之一，这对于流行性新冠肺炎的疫情控制具有重要的实际价值，同时也为今后新冠病毒的疫苗研究提供了有力的实验手段和科学基础。
       ELISA法已广泛应用于SARS、甲肝、流行性乙型脑炎、手足口病等多种病毒感染性疾病的特异性诊断中。相信通过各相关机构、企业的共同努力，新冠病毒IgM/IgG诊断试剂能够尽快用于新冠肺炎疫情的前线，以及今后的大规模筛查之中。

       本文作者：吴桐，中南大学湘雅医学院本科生；马健，湖南省免疫学会副理事长，中南大学基础医学院教授。