学术动态
海军军医大学袁继行团队揭示肿瘤肝转移过程中Kupffer细胞吞噬肿瘤细胞新机制
作者：袁继行 来源自：中国免疫学会 点击数：7348 发布时间：2023-10-19
适应性免疫检查点抑制剂（包括CTLA-4、PD-L1和PD-1抗体）在一些癌症的治疗中显示出一定的治疗效果，但患者响应率低。天然免疫细胞提供对肿瘤细胞的非特异性防御，特别是对肿瘤细胞的吞噬、清除。天然免疫细胞对肿瘤细胞的吞噬作用受到促吞噬（“eat me”，例如Fc受体）和抗吞噬（“don’t eat me”，例如CD47-SIRPα，PD-1-PD-L1等）信号的影响。各种吞噬细胞和肿瘤细胞使用不同的信号组合来调节吞噬作用。
肝脏是一个高度血管化的常见转移靶器官，肝癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌等多种来源的肿瘤细胞都易发生肝脏转移。肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞作为天然免疫防御的第一道防线，可吞噬播散的肿瘤细胞。然而，介导Kupffer细胞对肿瘤细胞识别、吞噬的特异性“吃我”或“不吃我”信号尚不清楚。鉴定Kupffer细胞中调节吞噬的信号可以为开发新的策略以增强Kupffer吞噬作用和限制肿瘤肝转移提供理论基础。
2023年10月9日，海军军医大学袁继行团队在Nature Immunology 在线发表题为“The ligation between ERMAP, galectin-9 and dectin-2 promotes Kupffer cell phagocytosis and antitumor immunity”的研究论文，该研究发现肿瘤细胞上的跨膜蛋白ERMAP通过galecin-9/dectin-2向肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞传递“吃我”信号，促进Kupffer细胞吞噬肿瘤细胞，以抑制肿瘤肝转移。
研究团队在体内肝转移模型中进行了全基因组规模的CRISPR-cas9敲除筛选，无偏倚地鉴定调节肿瘤肝转移的基因，发现靶向Ermap的gRNA在肝转移组织中富集。研究团队构建了ERMAP被敲除、敲低或过表达的肿瘤细胞系，体内肝转移实验发现ERMAP抑制肿瘤肝转移，但是体内肺转移实验发现ERMAP不调节肿瘤肺转移，体外功能学实验发现ERMAP不调节肿瘤细胞的增殖、迁移等行为，说明ERMAP在肝转移过程中的特异性作用依赖于肝组织微环境。研究团队进一步发现ERMAP特异性结合肝组织中的肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞，促进Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬。
ERMAP蛋白胞外段含有一个免疫球蛋白样V型结构域，利用该结构特点研究人员构建了ERMAP-Fc融合蛋白，通过亲和纯化联合质谱法寻找Kupffer细胞上与ERMAP结合的蛋白分子，发现galectin-9（半乳糖凝集素-9，Gal-9，一种糖基化结合蛋白）为ERMAP结合蛋白。小鼠的ERMAP第135位氨基酸和人的ERMAP第132位氨基酸是N-乙酰葡萄糖胺修饰位点。免疫共沉淀实验证明突变ERMAP糖基化位点（ERMAPN135A或ERMAPN132A）及去糖基化处理均能降低ERMAP和Gal-9的结合能力，证明ERMAP和Gal-9以糖基化依赖的方式相互结合。突变ERMAP糖基化位点或添加Gal-9中和抗体都可阻断ERMAP促进Kupffer细胞吞噬的作用。与之相应，突变ERMAP糖基化位点可大部分阻断ERMAP对肿瘤肝转移的抑制作用。ERMAP以糖基化依赖的方式与Gal-9结合在Kupffer细胞的表面，促进Kupffer细胞的吞噬作用，抑制肿瘤肝转移。
由于Gal-9没有跨膜域，可分泌到细胞外发挥功能，于是研究团队进一步探索了Kupffer细胞表面与ERMAP/Gal-9结合的膜受体分子，发现C型凝集素家族蛋白dectin-2结合ERMAP/Gal-9，且dectin-2在Kupffer细胞特异性高表达。Gal-9作为桥梁分子与肿瘤细胞表面的ERMAP和Kupffer细胞上表达的跨膜受体dectin-2形成桥接复合物。免疫共沉淀及ELISA实验都证明三者的相互结合。激光共聚焦检测显示ERMAP、Gal-9、dectin-2在Kupffer细胞上存在共定位。为验证dectin-2是否是介导ERMAP/Gal-9作用的关键受体，研究团队构建了dectin-2基因敲除小鼠，发现敲除dectin-2可大部分阻断ERMAP对Kupffer细胞吞噬及肿瘤肝转移的调控作用。证明ERMAP/Gal-9/dectin-2向Kupffer细胞传递“eat me”信号，抑制肿瘤肝转移。
此外，团队收集的人结直肠癌肝转移组织样本以及GEO数据库来源的结直肠癌肝转移数据分析都显示，ERMAP的表达与肝转移呈负相关，与肺转移、网膜转移、脑转移无相关性。也支持ERMAP特异性的抑制肿瘤细胞的肝转移。
总之，在本研究中，该团队聚焦肿瘤肝转移过程中肿瘤细胞与肝组织微环境之间的相互作用，历经九年研究探索，发现ERMAP/Gal-9/dectin-2作为不依赖于抗体的非经典“吃我”信号，特异性的促进Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬并进而抑制肿瘤肝转移。故激活ERMAP/Gal-9/dectin-2信号轴可作为增强Kupffer细胞吞噬能力和抗肿瘤先天免疫的一种策略，为临床转移性肝癌的治疗及预防提供潜在策略。
海军军医大学袁继行、孙树汉和复旦大学蔡国响为该研究论文的通讯作者，海军军医大学李洁、葛瑞良和同济大学刘小刚为该论文第一作者。本研究得到了上海交通大学基础医学院公共技术平台和海军军医大学临床肿瘤研究所的支持，同时得到国家自然科学基金、上海市科技创新行动计划、海军军医大学“双一流”学科建设经费的资助和支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41590-023-01634-7
肝脏是一个高度血管化的常见转移靶器官，肝癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌等多种来源的肿瘤细胞都易发生肝脏转移。肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞作为天然免疫防御的第一道防线，可吞噬播散的肿瘤细胞。然而，介导Kupffer细胞对肿瘤细胞识别、吞噬的特异性“吃我”或“不吃我”信号尚不清楚。鉴定Kupffer细胞中调节吞噬的信号可以为开发新的策略以增强Kupffer吞噬作用和限制肿瘤肝转移提供理论基础。
2023年10月9日，海军军医大学袁继行团队在Nature Immunology 在线发表题为“The ligation between ERMAP, galectin-9 and dectin-2 promotes Kupffer cell phagocytosis and antitumor immunity”的研究论文，该研究发现肿瘤细胞上的跨膜蛋白ERMAP通过galecin-9/dectin-2向肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞传递“吃我”信号，促进Kupffer细胞吞噬肿瘤细胞，以抑制肿瘤肝转移。
研究团队在体内肝转移模型中进行了全基因组规模的CRISPR-cas9敲除筛选，无偏倚地鉴定调节肿瘤肝转移的基因，发现靶向Ermap的gRNA在肝转移组织中富集。研究团队构建了ERMAP被敲除、敲低或过表达的肿瘤细胞系，体内肝转移实验发现ERMAP抑制肿瘤肝转移，但是体内肺转移实验发现ERMAP不调节肿瘤肺转移，体外功能学实验发现ERMAP不调节肿瘤细胞的增殖、迁移等行为，说明ERMAP在肝转移过程中的特异性作用依赖于肝组织微环境。研究团队进一步发现ERMAP特异性结合肝组织中的肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞，促进Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬。
ERMAP蛋白胞外段含有一个免疫球蛋白样V型结构域，利用该结构特点研究人员构建了ERMAP-Fc融合蛋白，通过亲和纯化联合质谱法寻找Kupffer细胞上与ERMAP结合的蛋白分子，发现galectin-9（半乳糖凝集素-9，Gal-9，一种糖基化结合蛋白）为ERMAP结合蛋白。小鼠的ERMAP第135位氨基酸和人的ERMAP第132位氨基酸是N-乙酰葡萄糖胺修饰位点。免疫共沉淀实验证明突变ERMAP糖基化位点（ERMAPN135A或ERMAPN132A）及去糖基化处理均能降低ERMAP和Gal-9的结合能力，证明ERMAP和Gal-9以糖基化依赖的方式相互结合。突变ERMAP糖基化位点或添加Gal-9中和抗体都可阻断ERMAP促进Kupffer细胞吞噬的作用。与之相应，突变ERMAP糖基化位点可大部分阻断ERMAP对肿瘤肝转移的抑制作用。ERMAP以糖基化依赖的方式与Gal-9结合在Kupffer细胞的表面，促进Kupffer细胞的吞噬作用，抑制肿瘤肝转移。
由于Gal-9没有跨膜域，可分泌到细胞外发挥功能，于是研究团队进一步探索了Kupffer细胞表面与ERMAP/Gal-9结合的膜受体分子，发现C型凝集素家族蛋白dectin-2结合ERMAP/Gal-9，且dectin-2在Kupffer细胞特异性高表达。Gal-9作为桥梁分子与肿瘤细胞表面的ERMAP和Kupffer细胞上表达的跨膜受体dectin-2形成桥接复合物。免疫共沉淀及ELISA实验都证明三者的相互结合。激光共聚焦检测显示ERMAP、Gal-9、dectin-2在Kupffer细胞上存在共定位。为验证dectin-2是否是介导ERMAP/Gal-9作用的关键受体，研究团队构建了dectin-2基因敲除小鼠，发现敲除dectin-2可大部分阻断ERMAP对Kupffer细胞吞噬及肿瘤肝转移的调控作用。证明ERMAP/Gal-9/dectin-2向Kupffer细胞传递“eat me”信号，抑制肿瘤肝转移。
此外，团队收集的人结直肠癌肝转移组织样本以及GEO数据库来源的结直肠癌肝转移数据分析都显示，ERMAP的表达与肝转移呈负相关，与肺转移、网膜转移、脑转移无相关性。也支持ERMAP特异性的抑制肿瘤细胞的肝转移。
总之，在本研究中，该团队聚焦肿瘤肝转移过程中肿瘤细胞与肝组织微环境之间的相互作用，历经九年研究探索，发现ERMAP/Gal-9/dectin-2作为不依赖于抗体的非经典“吃我”信号，特异性的促进Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬并进而抑制肿瘤肝转移。故激活ERMAP/Gal-9/dectin-2信号轴可作为增强Kupffer细胞吞噬能力和抗肿瘤先天免疫的一种策略，为临床转移性肝癌的治疗及预防提供潜在策略。
海军军医大学袁继行、孙树汉和复旦大学蔡国响为该研究论文的通讯作者，海军军医大学李洁、葛瑞良和同济大学刘小刚为该论文第一作者。本研究得到了上海交通大学基础医学院公共技术平台和海军军医大学临床肿瘤研究所的支持，同时得到国家自然科学基金、上海市科技创新行动计划、海军军医大学“双一流”学科建设经费的资助和支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41590-023-01634-7